骨科

自体软骨细胞移植术治疗关节软骨损伤的研究进展

作者:王泽民 来源:中国矫形外科杂志 日期:2015-03-09
导读

         目前临床上治疗关节软骨损伤的方法有多种,主要包括微骨折法、自体骨软骨移植、同种异体软骨移植及自体软骨细胞移植技术。HansenOM等通过一项兔子的体内实验,对不同密度软骨细胞结合MPEG-PLGA支架修复软骨缺损的效果进行比较,发现增加结合MPEG-PLGA支架软骨细胞的密度对修复效果并无积极作用。

  关节软骨的再生能力非常有限,这可能是由于其组织本身缺乏血管、神经,以及处于高压力和低氧、低营养环境中的性质所致,局部软骨损伤后,发展成骨关节炎的风险增加。目前临床上治疗关节软骨损伤的方法有多种,主要包括微骨折法、自体骨软骨移植、同种异体软骨移植及自体软骨细胞移植技术。

  与其他方法如微骨折法相比,自体软骨细胞移植术可以产生较多的透明软骨样修复组织,且具有更好的临床效果,该技术已经成为治疗膝关节软骨病变的最重要的手术方法之一,临床应用已扩展到治疗其他关节如踝、肩、髋、腕关节的软骨损伤。

  自1987年世界上第一个患者接受ACI手术以来,随着医学技术的进步以及组织工程的快速发展,在过去的20余年中,自体软骨细胞移植技术由第1代发展到了第3代,第1代为标准化的移植程序,包括软骨细胞体外培养,获取自体骨膜后缝合覆盖缺损区,植入软骨细胞,胶原封闭。第2代改用胶原膜缝合覆盖缺损区后注入软骨细胞悬浮液。基于生物材料的第3代技术也称为基质诱导的自体软骨细胞移植技术(MACI),是将软骨细胞种植于生物支架材料上,再将其按软骨缺损区剪裁后匹配覆盖缺损区。

  临床效果研究

  在过去的20多年中,已有相当数量患者接受自体软骨细胞移植治疗,学者通过对患者进行中长期的随访,比较了各代ACI技术的临床治疗效果。在早期的临床工作中,有学者使用第1代ACI技术治疗不涉及软骨下骨的全层软骨缺损,2年的随访结果提示:16例接受自体软骨细胞移植手术的股骨髁软骨病变患者中,有14例获得了良好的临床效果。2002年,PetersonL等报道61例患者在接受自体软骨细胞移植手术24个月后,其中50例获得良好效果,经过5~11年的随访,其中51例效果良好,对该51例中的12例患者行软骨修复组织活检结果显示其中8例表现出透明软骨的特点。最近的一项研究显示,70例膝关节软骨损伤患者在接受第1代ACI手术后,经过约10~12年的随访,77%的患者获得满意的临床效果。

  临床上为能免除取自体骨膜的手术步骤,尝试采用生物材料替代自体骨膜覆盖缺陷区。有学者使用绵羊进行了一项研究,比较了骨膜和Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白覆盖软骨缺损区的效果,研究发现骨膜可刺激骨软骨的致密化,但两者在对缺损区的组织修复效果上无明显差异。

  在软骨修复方面,有学者对第1、2代自体软骨细胞移植技术的效果进行了比较,也得到了相似的结果,该研究未对软骨下骨进行比较,但发现在因过度增生造成的并发症及二次手术率上,2代技术之间无明显差异,其他研究发现使用骨膜覆盖软骨缺损区相比使用Ⅰ/Ⅲ型胶原膜覆盖,前者有更多的患者出现软骨移植后的过度增生,以及较高的再手术率(9%)。在第3代ACI技术中,生物材料除了作为软骨缺损区的覆盖材料外,同时也充当了细胞体外培养的载体。

  SteinwachsM等,在2009年发表了使用Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白支架作为软骨细胞载体的研究,并于之后发表了随访2年后的临床结果。VijayanS等使用同样方法,将Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白支架作为软骨细胞载体来修复膝关节软骨损伤,并进行了2~8年的随访。最近的一项研究显示,80例膝关节全层软骨缺损的患者,在接受使用Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白支架作为软骨细胞载体的ACI手术后,经过3年的随访,其中83%的患者获得良好的临床效果。

  总之,经过对各代ACI技术长期的临床效果研究,在接受自体软骨细胞移植治疗的患者中约75%~80%的患者可获得良好的临床效果。有少数研究对采用自体软骨细胞移植技术治疗的关节软骨缺损区修复组织使用关节镜和活检组织学检查发现,各代ACI技术均不能对关节软骨缺损区以一种持续及可预测的方式达到透明软骨修复。这也是目前ACI技术所面临的问题之一。

  软骨细胞体外培养

  软骨细胞体外培养过程的主要目的是增加细胞数量,培养的外环境条件通常为置于5%CO2的37℃恒温箱中培养。对优化软骨细胞体外培养的研究此前对使用自体血清以及相关生长因子等方面较多。最近,有学者分别对低氧培养和不同培养表面在优化软骨细胞体外培养方面进行了研究,FoldagerCB等为确定软骨细胞培养时一组参考基因在低氧培养条件下的稳定性,对软骨细胞培养中通常被认为在常氧条件培养下稳定的一组基因在低氧培养下的稳定性进行了研究,其将软骨细胞分别置于21%,5%和1%氧含量条件培养,结果发现核糖体蛋白L13a(RPL13A),β2-微球蛋白(β2M),和人类的RNA聚合酶Ⅱ(RPII)等基因在缺氧条件下是最稳定的,而传统的参考基因,如3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)和β肌动蛋白(ACTB)基因则不稳定。

  另一项研究通过将传统的软骨细胞培养条件结合3D培养和低氧条件发现,相比在2D和常氧培养条件下,3D和低氧培养对软骨细胞的体外培养具有更积极作用。传统的软骨细胞培养方法,容易导致软骨细胞表型的变化并分化为纤维样软骨细胞。RosenzweigDH等使用了一种新的表面扩展培养系统来抑制软骨细胞去分化,通过使用一个高弹性的硅橡胶表面,可在限定的培养期间不断延伸其表面积直至达初始表面积的6倍,从而保持了软骨细胞在高密度的同时,限制了接触抑制和减少传代培养的需要,与传统的使用刚性聚苯乙烯表面进行软骨培养相比,研究发现使用该方法培养的软骨细胞具有更多软骨细胞样形态的细胞,同时软骨细胞相关标志物RNA水平也表现出高表达。

  组织工程

  生物材料

  组织工程的发展对ACI技术的不断改进有着重要意义,在过去的几年中,组织工程对于改进自体软骨细胞移植技术的方法主要集中在生物材料领域,这些生物材料包括天然或人工合成的聚合物以及可注射的如凝胶等支架材料。一个良好的组织工程生物材料能否应用于临床取决于多个因素,其应具备良好的生物相容性、可降解性、一定的机械稳定性及无细胞毒性等条件。

  一些支架材料起着外源性细胞载体的作用,可以促进软骨细胞的移动、黏附、增殖及分化,或者提供结构支持。温敏型聚乳酸水凝胶(MPEG-PLGA)是一种合成聚合物支架材料,作为MACI技术所应用的新生物材料,与Ⅰ/Ⅲ型胶原等天然聚合物一样常用于修复软骨缺损的治疗,对其研究也较多。LindM等通过在山羊体内实验研究,发现软骨细胞结合MPEG-PLGA支架材料较微骨折技术及软骨细胞结合纤维蛋白凝胶表现出更好的修复软骨缺损区效应,但作为新型材料仍需要长期随访进一步研究。

  HansenOM等通过一项兔子的体内实验,对不同密度软骨细胞结合MPEG-PLGA支架修复软骨缺损的效果进行比较,发现增加结合MPEG-PLGA支架软骨细胞的密度对修复效果并无积极作用。有研究将硫酸软骨素(DS)加入MPEG-PLGA支架中,观察其是否较单独使用MPEG-PLGA支架能有利于修复软骨缺损,发现此法对修复软骨缺损并无有利作用。除MPEG-PLGA等支架材料外,近年开发的其他类型的生物材料也展现出良好的临床应用前景。

  PulkkinenHJ等将重组人Ⅱ型胶原作为支架材料与软骨细胞结合后,植入兔的关节软骨缺损区,发现该方法对软骨缺损区的修复填充及修复组织的生物力学性能较之空白组均有提高,同时也表现出良好的生物相容性。ShahRN等采用超分子生物活性材料制成用于软骨缺损治疗的可注射性的自组装生物材料,该材料可以缓慢释放软骨再生纤维转化生长因子β1,体外试验发现该材料可促进人骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化和存活,同时还发现该材料能促进在无外源性生长因子加入情况下使用微骨折技术治疗全层软骨缺损的关节软骨的再生。

  TohWS等报道的一种可注射及可生物降解的透明质酸酪胺水凝胶材料,具有可调节的三维微环境,在软骨成骨过程中可调节软骨细胞的凝结聚集,并对软骨细胞的空间排列,基质合成和整体的组织发生过程均有积极作用。

  软骨细胞与支架的结合

  细胞与支架的结合能力与细胞的粘附和迁移密切相关。细胞与细胞外基质和支架材料黏附的过程由整合素引导。生物材料包含整合素配体或配体结合材料,整合素的重要配体包括纤维连接蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白。有学者发现软骨培养时加入DS(硫酸软骨素)可以使纤维连接蛋白的表达增加,这可能有助于软骨细胞早期的黏附和迁移以及随后的软骨修复。纤维连接蛋白一般出现于软骨形成的早期阶段和成熟关节软骨内。

  此前的一项研究表明,软骨细胞通过含α5整合素(即α5β1整合素)与纤连蛋白结合,该过程可作为细胞生存的信号之一,但通过α5β1整合素结合纤连蛋白片段的过程同时也会导致基质金属蛋白酶-13(MMP13)合成增加,可致基底膜及细胞外基质的降解,可见纤连蛋白的增加既存在潜在的好处,也有潜在的负面影响。此外,KutsunaT等最近的一项研究发现在体外TGFβ诱导的软骨形成过程中,通过siRNA抑制纤维连接蛋白可导致聚集蛋白多糖的表达增加,其对关节软骨的形成具有积极意义。

  软骨细胞的接种密度是软骨组织工程的另一个重要因素,确定最佳的软骨细胞接种密度也是自体软骨细胞移植治疗中需要解决的问题。最近有研究针对软骨种子细胞接种密度对相关文献进行分析后,发现细胞接种密度和临床表现之间无明确关联。但目前临床上各代ACI技术采用的移植软骨细胞密度稍有差别,第1、2代技术采用骨膜或胶原膜覆盖移植,多采用30×106/cm3的细胞密度,如关节软骨缺损面积为2cm×3cm,厚度为2mm的区域,约需要36×106个细胞,第3代技术移植细胞密度可相对较低,约为20×106/cm3,但在一些临床前研究中普遍倾向于采用较高的细胞密度,这可能是软骨修复受多因素影响的结果。理想的软骨细胞密度可能与支架材料、患者年龄、细胞增殖力等因素有关,目前关于软骨细胞接种密度的争论仍然存在,其在软骨缺损再生过程中的作用机理仍需进一步研究。

  组织学评价

  应用于自体软骨细胞移植技术中软骨再生及修复组织半定量评价的组织学评分系统有多个,根据不同应用范围可分为体外和体内两种,对组织学评分系统合理应用及改进的研究也是自体软骨细胞移植技术的重要方面。GroganSP等对应用于体外软骨组织的可视化常规评价系统进行了改进,可以快速和有效的评估在体外产生的软骨组织。Mainil-VarletP等对原有的改良O'Driscoll评分法(MODS)和国际软骨研究协会视觉评定量表I(ICRSI)两种评分系统的可重复性进行研究后提出了一种新的组织学评分法ICRSⅡ,该方法较前两者明显降低了较高的读者差异性等缺点。RutgersM等对多个应用于软骨组织学评价的系统进行有效性和实用性研究后发现,O'Driscoll评分法和国际软骨修复协会(ICRS)Ⅱ评分法更适用于体内修复软骨的组织学评价,“伯尔尼评分法”则更适合于体外软骨的组织学评价。

  软骨细胞追踪检查

  软骨细胞移植入体内后的追踪检查是自体软骨细胞移植技术的重要一环,包括对植入后的软骨细胞存活程度以及是否均匀定植于软骨缺损区等方面的检查,目前较好的方法是通过细胞内跟踪标记的方式。最近有研究使用极微氧化铁颗粒(VSOPs)作为细胞内标记物,以核磁共振成像技术(MRI)成功的在藻酸盐基上对标记的软骨细胞进行了4周的追踪观察。极微氧化铁颗粒是柠檬酸包裹的颗粒,其直径为11nm,包括一个5nm的铁核。在核磁共振自旋回波T2加权像可呈现出低信号。极微氧化铁颗粒相比常用的超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)更细,也不需要转染剂来增加在非吞噬细胞的摄取,而是通过非特异性的胞内吞饮方式被摄取。

  在标记物用于对体内细胞存活和分布情况的评估前,需要在体外对标记物对细胞的影响进行深入的实验研究,细胞毒性可导致细胞增殖率下降及细胞死亡率升高,标记物对细胞附着、迁移、胞外基质分子的合成等方面的影响,都可能会严重混淆对体内标记的软骨细胞移植后的结果评价。

  展望

  自体软骨细胞移植术作为目前临床上治疗关节软骨缺损的主要方法,其临床治疗效果已经得到肯定,技术特点及方法也不断改进,但仍未能理想的对软骨缺损区以持续稳定的方式行透明软骨修复,从而恢复关节软骨良好的生物力学性能。组织工程化软骨仍将是今后的热点,结合对支架材料、间充质干细胞在软骨修复方面的研究,以期找到一种能够完全修复软骨缺损的方法。目前,自体软骨细胞移植治疗仍需要较高费用,其临床推广应用存在困难,如何有效地降低治疗成本也是需要解决的问题。自体软骨细胞移植技术的发展还依赖于多个方面,如软骨细胞的优化培养,新型生物材料的研究以及康复治疗的改进等。

  来源:中国矫形外科杂志2015年2月第23卷第4期

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  关键词:自体软骨细胞移植软骨损伤修复

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